为确定诊断必须做脑脊液检查，脑脊液压力正常或轻度增高。脑脊液外观无色和清亮。细胞计数白细胞增高，介于10～500/mm3，脑脊液的白细胞计数罕有低于10/mm3或高于1000/mm3，但流行性腮腺炎和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒性脑膜炎的脑脊液白细胞可高达1000/mm3。
脑脊液常规检查：为确定诊断必须做脑脊液检查，脑脊液压力正常或轻度增高。脑脊液外观无色和清亮。细胞计数白细胞增高，介于10～500/mm3，脑脊液的白细胞计数罕有低于10/mm3或高于1000/mm3，但流行性腮腺炎和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒性脑膜炎的脑脊液白细胞可高达1000/mm3。增高的白细胞分类主要为淋巴细胞，但一些病例早期，也可表现为多形核白细胞突出，遇此情况应于24～48小时后复查脑脊液。若是病毒性脑膜炎，此时脑脊液中白细胞明显由多形核为主转换为单核细胞为主，但细胞总数、蛋白和糖不改变。脑脊液蛋白轻度增高，糖水平正常或轻度减低。

一般病毒性脑膜炎脑脊液的糖水平高于同时血糖水平的50%。虽有时可见脑脊液的糖水平和血糖水平的比值为0.3-0.5，但若二者的比值低于0.3时应考虑细菌或真菌感染。但在腮腺炎病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、单纯疱疹和肠道病毒所致的脑膜炎时，其脑脊液糖水平可较低，于但在连续复查时，不会呈进行性下降。所以，单凭一次脑脊液检查的结果有时不可能与细菌性脑膜炎鉴别开来。当脑脊液中白细胞总数超过500/mm3，其中95%为多形核白细胞，同时蛋白含量超过200mg/dl，且糖水平低于同时血糖的50%时，病毒性脑膜炎的可能性不大。若脑脊液中发现红细胞应与单纯疱疹病毒感染和蛛网膜下腔出血相鉴别。